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5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye)

产品编号 产品名称 规格 价格(元) 说明书
A0605A 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 40T×50μl体系 250
A0605B 200T×50μl体系 1000
G5 超保真DNA聚合酶(性能等同于NEB Q5超保真DNA聚合酶)来源于高保真Pfu DNA聚合酶,具有很强的3’-5’外切酶活性。经基因工程改造后,其具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力,此外其还具有6kb/min的延伸速度。扩增能力强、保真性高,可用于载体构建、突变修复、基因合成、DNA测序等对保真性能要求较高的试验。该酶的扩增产物为平端产物,不含“A”尾。该酶以λDNA为模板扩增20kb基因片段,以人基因组为模板扩增12kb的基因片段。
5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(性能等同于NEB Q5热启动超保真PCR Mix)是经优化的即用型PCR预混物,含有经抗体封闭的热启动G5 超保真DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂和稳定剂,使用时只需加入模板、引物和灭菌水即可进行PCR扩增,大大简化了操作过程、提高了效率、减少了PCR操作过程中的人为误差。具有快速简便、重复性高、特异性好、灵敏度高和稳定性好的特点。该制品中已经含有溴酚蓝染料,PCR扩增完毕后可直接点样于琼脂糖凝胶,无需再加入DNA Loading Buffer。

组份

名称 40T(50μl体系) 200T(50μl体系)
5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 0.4 ml 0.4 ml x5

主要特征

  • 具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力。
  • 顶级的扩增速度,在目的条带≤2kb时扩增速度可达4kb/min以上。
  • 具有良好的模板兼容性,对于基因组、质粒、cDNA、λDNA模板都有良好的扩增。
  • 优异的长片段扩增能力,以λDNA为模板可扩增20kb产物。
  • 良好的扩增灵敏度,人基因模板低至1ng也可以有效扩增。
  • 应用

    基因合成、突变修复和平端克隆。

    储存

    长期储存置于-20°C以下,可保存2年,避免反复冻融;短期使用置于4°C(3个月)保存,一经融化后请放置于4°C,勿再冻存。

    实例

    1. 良好的模板兼容性和长片段扩增
    使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix以 Gdna(A)、λDNA(B)、Hela Cdna(C)为模板扩增不同靶基因,结果显示5XHotStart HiFi G5 PCR Mix具有优异的长片段扩增能力,基因组可达12kb以上、λDNA可达20kb以上、Hela cDNA可扩增至7.6kb以上。 A: 1~5 分别为以gDNA为模板扩增的500bp、2kb、5kb、8kb、12kb PCR产物; B: 1~7 分别为以λDNA为模板扩增的 500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb PCR产物; C:1~8分别为以cDNA为模板扩增的166bp、552bp、960bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp、7600bp PCR产物。M:Marker 10000。
    基因名称 模板使用量
    gDNA:500bp、2kb、5kb、8kb、12kb ≤2kb 50ng
    2kb~8kb 100ng
    >8kb 200ng
    λDNA:500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb 50 ng
    Hela cDNA:166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp ≤2kb 相当mRNA 50ng
    >2kb 相当mRNA 200ng

    ≤2kb

    2~8 kb

    ≥ 8 kb

    95°C,2min

    95°C,2min

    95°C,2min

    95°C,20s

    58°C,20s

    72°C,30s32cycles

    95°C,20s

    58°C,20s

    72°C, 2kb/min 32cycles

    95°C,20s

    58°C,20s

    72°C, 1kb/min 32cycles

    72°C,2min

    72°C,2min

    72°C,2min

    高保真PCR Mix
    2.不同延伸速度对于扩增的影响
    使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix,以gDNA为模板扩增2259bp(A)和4564bp(B)目的片段,分别用不同的延伸时间,结果表明当目的片段长度≤2259 bp时G5 PCR Mix的延伸速度在4kb/min以上,而片段长度≥4564bp时延伸速度为2kb/min。A图1-4延伸时间分别为10s、30s、1min、2min,B图5-8同A图1-4;M: DNA Marker 10000。
    高保真PCR Mix
    3. 扩增灵敏度测试
    使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix,以gDNA为模板扩增2259bp目的片段,设置不同的模板梯度,结果表明基因模板低至1ng 时G5 PCR Mix也可以有效扩增。图中1-10模板量分别为0.5ng、1ng、5ng、10ng、25ng、50ng、100ng、200ng、0.5μg、1μg;M: DNA Marker 10000。
    高保真PCR Mix

    常见问题及解决方案:

    无扩增或产量低 循环数
    退火温度
    模板DNA纯度和用量
    延伸时间
    引物用量
    引物设计
    增加循环数至35~40cycles
    以2℃为单位降低退火温度
    使用高纯度的模板DNA,使用合适的模板量。
    延伸时间按1 kb/min设置
    在0.1μM~0.5μM之间选取合适的引物量
    重新设计优化引物
    出现杂带或Smear 退火温度
    引物浓度
    循环数
    模板DNA使用量
    引物

    以2℃为单位提高退火温度
    降低引物浓度至0.2μM
    降低循环数至25~28cycles
    使用合适的模板量,不要过多使用
    重新设计优化引物