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LAMP核酸检测技术概览

一、LAMP核酸扩增技术的优势

自1980年PCR技术发明后,基于PCR技术的核酸检测迅速应用到临床、食品、环境的检测中,并成为核酸检测的金标准。但PCR的检测技术存在设备体积大、粗样品耐受性差、反应时间长、灵敏度难以达到单copy等诸多缺点,已经难以满足现代核酸检测的要求:速度快(<30min)、超灵敏度(1-5copy/test)、大体积粗制样品直检(20-50%反应体积样本量)、野外操作、简单化操作等方面的指标。 在过去的20年中科学家一直尝试通过恒温扩增的方法来实现上述目标,这其中包括RCA(rolling circle amplification)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)、RPA(recombinase polymerase amplification)、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)、SDA(strand displacement amplification)、HDA (helicase dependent amplification)、TMA(transcription-mediated amplification)等新型恒温核酸扩增技术。
在这些恒温扩增技术中,以2000年首次报道的LAMP法尤为耀眼和引人关注,目前占据超过60%的恒温检测市场。核酸检测对LAMP技术如此亲赖,究其原因,得益于其它恒温检测技术难以达到LAMP技术的综合性优势:
  • 反应速度极快,优化的引物组合可以达到15min内检测到单copy分子,检测速度接近或超过RPA和NASBA;
  • 能够达到超敏检测极限,1-5copy的分子能够稳定检出,稳定性极高,其它任何恒温技术难以达到如此稳定的水平;
  • 结果判读形式的多样化,适应各种环境和条件下的核酸快速检测。LAMP扩增作为终点判读形式,可不借助任何其它辅助设备,裸眼观察检出结果。基于钙黄绿素、HNB、红黄变色、OG橙绿变色都可以肉眼观察结果。LAMP同样可借助浊度仪进行实时浊度分析。在反应体系中加入SYBR Green荧光染料后,可使用小型恒温荧光仪进行实时检测。以上这些结果判读形式均可在野外等非标准实验室进行,所需设备简单、小巧、价格低廉、便于普及。除此外,传统实验室中的荧光定量PCR仪,同样可进行LAMP检测,可采用SYBR Green、MB探针法或LAMP TaqMan探针法,对于经常操作PCR检测的人员来讲,可以无缝对接、无需更换设备。
  • 对RNA病毒的漏检率低,由于RNA病毒的突变率较高,在PCR检测中个别突变对PCR的扩增影响较大,容易造成病毒漏检的假阴性。而LAMP识别靶基因8个区段,在这些识别区段中个别的突变对LAMP扩增影响较小,不易产生漏检。
  • 试剂稳定、易于使用。同RPA、NASBA等技术相比,LAMP与PCR法都采用单一酶(或双酶)系统进行反应,生产批次稳定、反应酶系统耐高温,试剂稳定性好。在检测试剂中仅包含酶mix一管、引物/探针一管,使用方便,在荧光定量PCR机器上可方便的进行高通量检测。而RPA、NASBA等系统需要多个复合酶,比例严谨、试剂稳定生产困难、保存运输条件苛刻、难以高通量应用。
  • LAMP法对耐受杂质能力最强。PCR、RPA、NASBA等扩增体系均需要进行核酸纯化制备,在进行粗制品的直扩系统中,上样量均较小(<10%),无法大体积上样,杂质对这些扩增方法均影响较大。而LAMP法对大多数样本的耐受性能达到20%以上,个别样本的含量可以容忍到50%以上,如此大的上样体积量,决定了LAMP具有更高的检出率。
  • 扩增反应同步病毒灭活,由于LAMP反应温度在65℃的高温条件下进行,在病毒液直扩中,反应过程中即可灭活病毒,降低耗材的污染风险。
  • 高特异性,随着LAMP用酶不断改进、反应缓冲液的不断优化、探针技术的搭配、引物设计理念的不断改善,LAMP的非特异性扩增获得质的提升,目前在优化的LAMP体系中,假阳性的情况已经得到根本改善,假阳性比例接近甚至低于PCR方法。
  • 多重荧光探针的应用。随着Bst DNA聚合酶和反应缓冲体系的不断改进、LAMP TaqMan技术的发明,多重LAMP体系得以建立。这种多重的LAMP技术,达到了金标准TaqMan PCR的多靶基因、内参质控样本的相同性能,符合到临床应用的标准。

二、LAMP反应基础用酶和相关试剂盒开发历程

HaiGene于2014年启动LAMP技术平台的研发与搭建,基于分子工具酶研发经验和蛋白质电子重构架技术,历时6年时间打造出LAMP全系DNA聚合酶,包括:Bst2.0Bst3.0Bst4.0、Bst5.0、Bst7.0 DNA聚合酶。精心优化的反应体系,打造出性能卓越、高扩增效率、高特异性的LAMP预混Mix系列试剂,便于科研和诊断试剂的开发。上百万次的测试,总结出更为高效的引物设计理念,为客户提供免费的LAMP引物设计服务。多样化的预混显色试剂,满足不同检测需求,包括:可视化变色显色(红黄变色、OG变色、HNB变色)浊度法SYBR Green荧光法、LAMP TaqMan荧光探针法多重LAMP TaqMan荧光探针法。除了提供顶级LAMP用酶和预混mix试剂外,HaiGene协助客户进行LAMP试剂研发。

三、HaiGene LAMP产品体系及应用

1. 原料基础用酶
HaiGene原料酶列表(全系提供含甘油和无甘油的酶版本)
  扩增速度 逆转录活性 杂质耐受性 dUTP识别能力 应用
Bst 2.0 ** ** ** **** DNA LAMP SDA反应
Bst 3.0 **** *** **** ** LAMP和RT-LAMP反应
Bst 4.0 **** ***** **** ** RT-LAMP最佳用酶
2. 不同显色方式的优缺点比较
  红黄变色 OG变色 HNB变色 浊度法 SYBR Green LAMP TaqMan
结果判读方式 裸眼可视 裸眼可视 裸眼可视 裸眼可视
浊度仪
恒温荧光仪
定量PCR仪
恒温荧光仪
定量PCR仪
反应速度 20-30min 15-20min 20-40min 25-30min 15-25min 15-30min
灵敏度 <5copy <5copy <50copy <10copy <5copy <5copy
单copy检出率 30% 30-50% 困难 30% >50% >50%
抗杂质能力 ★★ ★★★★★ ★★ ★★★★★ ★★★★★ ★★★★★
假阳性控制能力 ★★★ ★★ ★★★ ★★★ ★★★★★
高通量检测能力 ★★★★ ★★★ ★★★ ★★★★★ ★★★★★
易用性 ★★★★ ★★ ★★★ ★★★★★ ★★★★★
3. LAMP预混Mix系列选取指南
显色方式 检测模板 试剂形式 推荐选用产品
 
可视化系列(红黄变色)
DNA 液体 A3824-01
可冻干 A3826-01
RNA 液体 A3824-01
可冻干 A3825-01
     
       
 
可视化系列(OG橙绿变色)
DNA 液体 A3824-02+A3821
可冻干 A3826-02+A3821
RNA 液体 A3824-02+A3821
可冻干 A3825-02+A3821
     
       
 
可视化系列(HNB变色法)
DNA 液体 A3802
     
       
 
浊度法
DNA 液体 A3824-02
可冻干 A3826-02
RNA 液体 A3824-02
可冻干 A3825-02
     
       
 
SYBR Green荧光法
DNA 液体 A3824-03
可冻干 A3826-03
RNA 液体 A3824-03
可冻干 A3825-03
     
       
       
 
LAMP TaqMan荧光法
DNA/RNA 液体 定制
冻干 定制
     
       
 
多重LAMP TaqMan荧光法
DNA/RNA 液体 定制
冻干 定制