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HaiGene创新性技术平台----超敏TaqMan One-Step Nested PCR法

                                            ——————超越传统TaqMan PCR,卓越的灵敏度
产品编号 产品名称 规格 价格(元)
A2270 超敏巢式荧光PCR核酸检测试剂盒开发服务 询价
A2270-01 SD 2.0 DNA Polymerase(1.25 U/µl) 250U 2450
>25 KU 询价
A2270-02 SD 3.0 DNA/RNA Polymerase(1.25 U/µl) 250U 2450
>25 KU 询价
A2270-03 FAM Nested P-Bond TaqMan Probe 1 OD×4 2250
5 OD×8 询价
A2270-04 HEX Nested P-Bond TaqMan Probe 1 OD×4 2250
5 OD×8 询价
A2270-05 ROX Nested P-Bond TaqMan Probe 1 OD×4 2250
5 OD×8 询价
A2270-05 Cy5 Nested P-Bond TaqMan Probe 1 OD×4 2250
5 OD×8 询价
A227018 超敏双重非洲猪瘟巢式荧光PCR检测盒
(TaqMan One-Step Nested PCR法)
100T×25 µl 2750
A227019 超敏新冠D614G分型巢式荧光RT-PCR检测盒
(TaqMan One-Step Nested PCR法)
100T×25 µl 5500
A227018 超敏三重新冠巢式荧光RT-PCR检测盒
(TaqMan One-Step Nested PCR法)
100T×25 µl 3750

一、TaqMan One-Step Nested PCR核酸扩增技术的原理

巢式PCR具有很高的灵敏度和特异性,但传统的巢式PCR采用两对引物,通过两轮PCR,进行目标产物的扩增。即,采用一对外侧引物进行第一轮扩增,之后再用一对内侧引物以第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增。由于传统巢式PCR需要两步扩增,这种操作的不便性,使得其高灵敏度的特性难以应用到临床诊断中。在单管巢式PCR的扩增中,由于内侧引物会阻碍外侧引物的扩增,因此标准的Taq DNA聚合酶不能在单管巢式PCR的扩增中,发挥其高灵敏度的特性。仅有采用耐高温、且具有链置换活性的聚合酶(SD Polymerase),才能保证在单管反应中,内外两侧引物同时扩增,达到巢式PCR高灵敏的特性。
在标准PCR过程中,使用上游和下游两条引物对靶基因进行热循环扩增,每经过一个循环的扩增,产物最多变为2倍。而在One-Step Nested PCR(或称为PCDR法,Polymerase Chain Displacement Reaction)的扩增中由于使用两条上游引物和两条下游引物,因此在每次热循环过程中,产物增加近4倍,在经过30-40次循环后,核酸产物将会高于PCR法成千上万倍,并且所需的循环数更少。在核酸检测的实验中,One-Step Nested PCR法比标准PCR法灵敏度要高10-100倍,并且更容易开发出高灵敏的检测试剂盒。

图1: One-Step Nested PCR工作流程的便利性   图2:One-Step Nested PCR法的高灵敏度原理
  一步法巢式Taqman qPCR原理
传统的巢式PCR采用2次PCR扩增,而One Step Nested PCR法单管一步完成,更利于使用。   标准PCR扩增,在一个热循环后,最多由1分子DNA变为2分子(倍增为2n,n=循环数)。而在采用4引物的One-Step Nested PCR扩增反应中,每经过一次热循环扩增,最多由1分子DNA变为4分子(倍增为4n)。

二、HaiGene的TaqMan One-Step Nested PCR荧光法核酸检测技术

一步法巢式PCR(One-Step Nested PCR)技术最早报道于2013年,虽然其拥有高灵敏度的检测特性,但始终未能在核酸检测领域获得广泛应用。其主要原因是SD聚合酶的链置换活性过于强烈,而导致外切酶活性作用的机会太弱,导致高信噪比的TaqMan探针无法应用于One-Step Nested PCR。因此,One-Step Nested PCR的荧光探针检测只能依靠特异性和信噪比欠佳的发卡FRET探针。HaiGene凭借在分子工具酶改造工作中积累的的丰富经验,开发出具有探针切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase,结合独有的P-Bond锚定探针技术,将高信噪比的TaqMan探针应用到One-Step Nested PCR上,建立起了TaqMan One-Step Nested PCR方法。运用TaqMan One-Step Nested PCR方法检测DNA或RNA分子,在检测灵敏度和扩增速度方面,都是传统TaqMan PCR法难以企及的。对于下游用户来讲,TaqMan One-Step Nested PCR在试剂配制、反应程序、所需设备等各个方面,几乎完全一致,不存在任何操作变化的屏障。因此,不论对于实力强劲的大型基因公司继续巩固现有市场,还是对于起步发展阶段的中小型基因公司抢占市场份额,TaqMan One-Step Nested PCR技术都将是未来基因检测市场争夺战中的最有利武器。
表1  TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能对比
  TaqMan PCR TaqMan One-Step Nested PCR
扩增引物数 两条 四条或六条
探针 双标荧光探针 双标P-Bond荧光探针
热循环倍增数 <2 >2
扩增条件 热变性循环 热变性循环
检测设备 标准定量PCR仪 标准定量PCR仪
数据判读方式 扩增曲线或Ct值 扩增曲线或Ct值
对模板变异敏感度 较敏感 不敏感
5 copy灵敏度 开发难度大,判读困难 开发容易,判读容易
5 copy Ct值 通常>34 通常<28
DNA扩增用酶 Taq SD 2.0
RNA扩增用酶 Taq+MLV、TTx、mTTx、Z05 SD 3.0

三、TaqMan One-Step Nested PCR荧光法核酸检测技术应用策略

在TaqMan One-Step Nested PCR的实验中,采用4条扩增引物的情况下,检测灵敏度和扩增速度较传统TaqMan PCR法会大幅提高。同时,由于采用了4条扩增引物,当在检测变异度较高的RNA病毒时,突变对扩增引物的影响显著降低,从而避免了漏检的可能性。当再增加一条检测探针时,对突变的敏感度进一步降低,此时已经与TaqMan PCR的双重检测防止漏检的设计完全相同,但One-Step Nested PCR法检测灵敏度更高。为了进一步提高检测灵敏度和扩增速度,可以再增加一对扩增引物,采用6引物进行扩增。
一步法巢式Taqman qPCR 探针设计策略 图3:TaqMan One-Step Nested PCR引物和探针设计原理

四、TaqMan One-Step Nested PCR的引物和探针设计原则

表2 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的引物设计参数对比
  TaqMan PCR TaqMan One-Step Nested PCR
扩增引物长度 18-26bp,条件完全相同
扩增引物TM值 55-60℃,条件完全相同(GC含量40-60%最佳
探针长度 20-35bp 20-28bp
探针TM值 一般68℃(>引物10℃) 一般63℃(>引物3-5℃)
扩增片段大小 <200bp <300bp(外侧)
    <150bp(内侧)
探针位置 与引物3’端间隔2-6bp 与引物3’端间隔4-20bp
TaqMan One-Step Nested PCR的引物和探针目前还没有专用软件,可自行根据其它常用软件调整设计,或发送我处,由我处免费协助提供设计。

五、TaqMan One-Step Nested PCR的扩增性能展示

1.以非洲猪瘟DNA病毒核酸检测为例,进行TaqMan One-Step Nested PCR与TaqMan PCR两种方法性能的比较。

传统Taqman qPCR检测猪瘟病毒核酸   一步巢式Taqman qPCR检测猪瘟病毒核酸
图4A:传统的TaqMan PCR法对10copy以下模板检测困难,
通常Ct>35,不易判读。
  图4B:TaqMan One-Step Nested PCR法5copy的
DNA模板Ct<26,单copy分子Ct<30. 结果易于判读。
2.以2019-CoV RNA病毒核酸检测为例,应用TaqMan One-Step Nested PCR进行检测。
一步巢式Taqman qPCR 新冠病毒核酸检测设计策略 图5A:针对2019-CoV的N基因使用的引物、探针策略图示

一步巢式Taqman qPCR检测新冠病毒核酸   一步巢式Taqman qPCR检测新冠病毒核酸
图5B:2019-CoV的N基因靶标区段1(FAM通道)灵敏度测试   图5C:2019-CoV的N基因靶标区段2(HEX通道)灵敏度测试
3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或变异毒株的分型检测。
一步巢式Taqman qPCR检测新冠病毒核酸D614G突变 图6A:针对2019-CoV的S基因的D614G突变使用的引物、探针策略图示

一步巢式Taqman qPCR检测新冠病毒核酸D614G突变   一步巢式Taqman qPCR检测新冠病毒核酸D614G突变   一步巢式Taqman qPCR检测新冠病毒核酸D614G突变
图6B:2019-CoV病毒
D614G分型结果
  图6C:2019-CoV病毒D614(野生型)
灵敏度测试
  图6D:2019-CoV病毒G614(突变型)
灵敏度测试

六、常见问题

问题1: TaqMan One-Step Nested PCR是否可以做定量分析?
回答:由于采用巢式扩增系统,每个循环的倍增在2-4之间(在6引物系统中会更高),而不是传统PCR的2倍关系,因此不建议进行定量检测。但Nested PCR在不同的梯度模板中仍然表现出很好的浓度梯度关系,仍然可以通过Ct值判读模板的含量区间。

问题2: 常规TaqMan探针能否代替Nested P-Bond探针?
回答:常规TaqMan探针对模板的绑定能力较P-Bond探针差很多,多数情况下切割效率低下,甚至不工作,因此不建议采用常规TaqMan探针。

问题3: 每一条Nested P-Bond探针都能100%工作吗?
回答:由于未知的原因,目前还不能保证每条Nested P-Bond探针100%工作,有个别的探针切割效率低下、甚至无信号。总体来言,Nested P-Bond探针的成功率>80%。

问题4: 怎样的设计才能达到单copy的检测水平?
回答:在采用6引物扩增系统中总能获得最高的检测灵敏度,但引物组合的筛选工作具有一定的挑战性。

问题5: TaqMan One-Step Nested PCR如何进行内参质控设计?
回答:在对内源内参进行扩增时,考虑到内源内参不需要很高的灵敏度,我们建议采用常规2条引物系统即可,通常内参扩增引物的使用浓度在100nM的浓度即可。内源内参通常采用ROX荧光标记。

问题6: TaqMan One-Step Nested PCR如何进行多靶基因设计?
回答:如果多靶基因设计的目标为,防止靶基因突变造成的脱靶(假阴性),那么通过在内侧引物区域内采用2条探针检测即可解决脱靶问题。如果多种病原单管检测的设计目标的话,由于使用的引物条数大幅增加,可参考MultiPlex设计方案对引物系统进行优化组合,这是具有一定挑战性的。

问题7:TaqMan One-Step Nested PCR可以进行直扩反应吗?
回答:SD 2.0 DNA Polymerase对杂质具有相当的耐受性,在DNA模板的检测中,可以采用粗制样品进行扩增。在DNA的检测中拭孖样本采用ddH2O浸泡后可以直接作为检测模板,拭孖样本的检测效果为最佳。血清、血浆样本对反应有一定的抑制作用,全血不能作为粗样本直接加入,稍后我们会给出详细的参数。由于SD 3.0 DNA/RNA Polymerase在反转录反应前,不能加热裂解样本,所以对RNA的模板检测来言,TaqMan One-Step Nested RT-PCR目前还不能进行粗样品的直接检测。现阶段,RNA粗制样本的直接检测请使用我处mTTx DNA/RNA聚合酶系统。HaiGene将很快推出耐高温且具有逆转录活性的SD 4.0 DNA/RNA Polymerase,局时TaqMan One-Step Nested RT-PCR将可以直接检测粗制RNA样本。