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T4多聚核苷酸激酶(3’磷酸酶活性缺失)

产品编号 产品名称 规格 价格(元) 说明书
C5002A T4多聚核苷酸激酶 200U 600
C5002B 2,000U 4,000
T4多聚核苷酸激酶能够催化ATP的 γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链(双链或单链DNA或RNA)的 5’-羟基末端以及3’-单磷酸核苷上。T4 多聚核苷酸激酶还具有3’磷酸酶活性,将3’-磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3’-单磷酸核苷和脱氧3’-二磷酸核苷上水解掉。该酶经修饰后,其3’磷酸酶活性缺失,但仍保留了所有激酶的活性。

组分

组分名称 数量
T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl) 20 μl/200 μl
10×T4 PNK Buffer 1 ml/1 ml×2
10mM ATP 100 μl/500 μl

应用

  • DNA 或 RNA 5´ 末端的磷酸化,以便进行连接反应。
  • DNA 或 RNA 的末端标记,用作探针和进行 DNA 测序
  • 将 3´ 端已经磷酸化的单核苷酸 5´ 磷酸化,制备pNp 底物,用于添加到 DNA 或 RNA的 3´ 端
  • 对 3´ 端有磷酸基团的寡核苷酸的 5´ 端进行标记

活性定义

1 单位指 37℃条件下,30 分钟内催化1nmol 酸不溶性[32P] 掺入所需要的酶量。

储存

-20℃可保存3年。

使用注意事项

(1)1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液:70 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM MgCl2,5 mM DTT,37℃ 温育。
(2)热失活:65℃ 加热 20 分钟。
(3)在放射性标记实验中,可用 1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50pmol的γ-[32P] ATP和20单位的酶37℃温育30分钟。
(4)T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性,但是为了适用于高活力的放射性标记反应,在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。因此在磷酸化修饰核酸时请单独添加终浓度0.5~1mM ATP。
(5)要提高平齐末端或5’凹陷末端的磷酸化效率,可在加入T4多聚核苷酸激酶前,先将DNA溶液于70℃加热5分钟,然后冰上冷却,并加入5%(W/V)的PEG-8000。
(6)一般来说,进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下,T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃ 温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接,无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它DNA片段的去磷酸化状态,则需要在连接反应前热失活T4多聚核苷酸激酶。